Wykaz Projektów
Streszczenie

Ocena toksyczności w badaniach in vitro wybranych związków chemicznych na starzejących się komórkach

Kierownik projektu: dr Katarzyna Miranowicz-Dzierżawska

Streszczenie projektu:

 

Celem projektu było określenie wpływu związków chemicznych stosowanych w przemyśle na starzejące się organizmy. Oceniano, w jaki sposób cytotoksyczność związków chemicznych oznaczana in vitro jest modyfikowana w  badaniach starzejących się linii komórkowych.

Przeprowadzono badania porównawcze in vitro wrażliwości późnych, przyjętych jako model starzejącego się organizmu człowieka, oraz wczesnych pasaży ludzkich komórek diploidalnych na cytotoksyczne działanie wybranych substancji chemicznych.

Umożliwiło to określenie, które z badanych związków chemicznych stanowią większe zagrożenie dla komórek u schyłku ich życia w porównaniu z zagrożeniem dla komórek młodych, a w konsekwencji mogą stwarzać większe zagrożenie dla zatrudnionych w kontakcie z nimi pracowników w starszym wieku. Stało się to także punktem wyjścia do opracowania materiałów dotyczących zagrożeń dla osób starszych, wynikających z narażenia na wybrane rozpuszczalniki organiczne, związki skali nano oraz biopaliwa, nieuwzględnianych dotychczas w ocenie ryzyka zawodowego wynikającego z ekspozycji na substancje chemiczne i działaiach je ograniczających.

W ramach projektu zrealizowano następujące cele szczegółowe:

‒     przeprowadzono ocenę cytotoksycznego działania sześciu rozpuszczalników organicznych (acetonu; 2-propanolu; 2-metoksyetanolu; 2-etoksyetanolu; 1,4--dioksanu oraz tetrahydrofuranu)  na kolejnych pasażach starzejących się komórek wyprowadzonych z układu oddechowego i skóry człowieka

‒     oceniono cytotoksyczność tlenków cynku(II) o wielkości cząstek < 50 nm oraz < 5 µm, tlenku ceru(IV) o wielkości cząstek < 25 nm oraz srebra w zawiesinie o wielkości cząstek 10 nm na wczesne i późne pasaże diploidalnych fibroblastów skórnych oraz płucnych

‒     porównano cytotoksyczne działanie czterech biopaliw otrzymanych w procesie transestryfikacji tłuszczów, takich jak: przeterminowany olej rzepakowy (BP I), odpadowy tłuszcz zwierzęcy (BP II),  roślinny olej posmażalniczy (BP III), oraz surowego oleju rzepakowego (BP IV)  na kolejne pasaże komórek CCD-8Lu oraz CCD-1136Sk.

Badania doświadczalne wykonano na dwóch starzejących się liniach komórkowych zakupionych w Amerykańskiej Kolekcji Kultur Typowych: linii diploidalnych fibroblastów płucnych CCD-8Lu (ATCCÒ CCL-201TM) oraz linii diploidalnych fibroblastów skórnych CCD-1136Sk (ATCCÒ CRL-2697TM). Do oceny cytotoksycznego działania badanych związków wybrano test redukcji bromku 3-(4,5-dimetylotiazolo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu w mitochondriach, który określa aktywność metaboliczną komórek (test MTT) oraz test pochłaniania czerwieni obojętnej oceniający integralność błon komórkowych (test NRU).

Porównując wartości IC50 wyznaczone dla badanych związków na fibroblastach pochodzenia płucnego oraz skórnego, stwierdzono, że oba typy komórek charakteryzują się podobną wrażliwością w stosunku do badanych ksenobiotyków.

Spośród badanych rozpuszczalników organicznych najmniej toksyczny, zarówno dla komórek linii CCD-1136Sk jak i CCD-8Lu, okazał się aceton, najbardziej toksyczny zaś był 2-etoksyetanol. Porównując wartości IC50 wyznaczone dla związków skali nano na komórkach obu linii komórkowych, stwierdzono, że najsilniejsze działanie cytotoksyczne miało srebro o wielkości cząstek 10 nm, natomiast najsłabiej działał tlenek ceru(IV) o wielkości cząstek < 25 nm. Wśród badanych biopaliw najsilniejsze działanie cytotoksyczne na fibroblasty skórne i płucne wykazywało biopaliwo o największej zawartości estrów kwasów tłuszczowych, które zostało uzyskane z odpadowego tłuszczu zwierzęcego (BP II), natomiast najsłabiej działało biopaliwo otrzymane z surowego oleju rzepakowego (BP IV). Prawidłowości takie obserwowano zarówno w teście MTT, jak i NRU.

Analizując krzywe zależności żywotności komórek od stężeń badanych substancji/mieszanin, stwierdzono, że wrażliwość starzejących się komórek na cytotoksyczne działanie ksenobiotyków może się zmieniać w miarę ich starzenia się ‒ zmiany te były wyraźniejsze w przypadku narażenia fibroblastów skórnych niż płucnych. W przeważającej większości przypadków komórki starsze stawały się bardziej wrażliwe w porównaniu z młodszymi na cytotoksyczne działanie badanych substancji/mieszanin. Prawidłowość taką zaobserwowano przy narażeniu kolejnych pasaży komórek CCD-1136Sk na wszystkie badane rozpuszczalniki organiczne z wyjątkiem 2-metoksyetanolu (aceton; 2-propanol; 2-etoksyetanol; 1,4-dioksan oraz tetrahydrofuran), przy narażeniu na działanie nanotlenku cynku(II), a także narażeniu na wszystkie badane biopaliwa otrzymane w procesie transestryfikacji tłuszczów odpadowych (biopaliwa II generacji). Analogiczne zjawisko występowało także przy narażeniu komórek wyprowadzonych z tkanki płucnej (CCD-8Lu) na biopaliwa BPIII oraz BPIV. W przypadku komórek wyprowadzonych z tkanki płucnej przy narażeniu na badane rozpuszczalniki oraz biopaliwo BPII występowało zjawisko odwrotne. Stwierdzono, że istotne znaczenie dla zróżnicowania cytotoksycznego działania badanych substancji/mieszanin na wczesne i późne pasaże fibroblastów ludzkich może mieć stężenie badanego związku, gdyż zjawisko różnej wrażliwości komórek młodych i starych obserwowano zwykle podczas ich narażenia na substancje/mieszaniny w środkowym zakresie stężeń efektywnych.

Uzyskane wyniki wskazują, że wrażliwość starzejących się ludzkich komórek, przyjętych jako model starzejącego się organizmu człowieka, na cytotoksyczne działanie rozpuszczalników organicznych, związków skali nano oraz biopaliw może się zmieniać w miarę ich starzenia się. W większości przypadków stawały się one bardziej wrażliwe, choć stwierdzono także, iż kolejne pasaże diploidalnych ludzkich fibroblastów mogą reagować odmiennie na cytotoksyczne działanie tych samych ksenobiotyków. Kluczowe znaczenie w cytotoksycznym działaniu związków chemicznych na młodsze i starsze pasaże komórkowe może mieć stężenie badanego związku.

Uzyskana wiedza na temat odmiennej reaktywności starzejących się komórek ludzkiego organizmu może być cenną wskazówką do tworzenia bezpiecznych warunków pracy dla osób starszych. Otrzymane wyniki powinny być brane pod uwagę w ocenie narażenia i przewidywaniu skutków narażenia seniorów na związki chemiczne, a także mogą stanowić podstawę do oceny ryzyka zawodowego, jak i jego ograniczania.

W ramach projektu zostały opracowane materiały szkoleniowe na temat zagrożeń dla pracowników 60+ stwarzanych przez rozpuszczalniki organiczne, związki skali nano i biopaliwa oraz zasad bezpiecznej pracy z nimi, a także materiały informacyjne do serwisu internetowego CIOP-PIB na temat oddziaływania związków chemicznych na starzejące się komórki.

Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych na seminarium weryfikującym zorgani-zowanym w ramach projektu wykazały, że przedsięwzięcia edukacyjne i upowszechniające wiedzę dotyczącą oddziaływania związków chemicznych na organizm są potrzebne w celu poprawy warunków pracy i mogą się przyczynić do ograniczenia zagrożeń występujących w przedsiębiorstwach.

Uzyskane wyniki badań ujęto w przygotowanych publikacjach (6) i upowszechniono w formie referatu (1) i doniesień zjazdowych w formie plakatu (3).

 

 

 

 

 

 

Oddziaływanie związków chemicznych na starzejące się komórki (materiały informacyjne)
Autorzy: dr Katarzyna Miranowicz-Dzierżawska, dr Jolanta Skowroń, dr Lidia Zapór
2016 r.

 

 



Jednostka: Pracownia Toksykologii

Okres realizacji: 01.01.2014 – 31.12.2016