Ocena in vitro poziomu programowanej śmierci komórkowej (apoptozy) w starzejących się komórkach pod wpływem wybranych substancji chemicznych o działaniu konserwującym stosowanych w przemyśle

Project manager: dr Katarzyna Miranowicz-Dzierżawska

Project summary:

Celem projektu było określenie wpływu wybranych substancji chemicznych o działaniu konserwującym stosowanych w przemyśle kosmetycznym i/lub farmaceutycznym na proces programowanej śmierci komórkowej (apoptozy) w starzejących się organizmach.

W ramach zrealizowanych prac przeprowadzono badania porównawcze in vitro nasilenia procesu apoptozy w podlegających starzeniu się ludzkich komórkach wyprowadzonych z układu oddechowego: CCD-8Lu (ATCC^Ò CCL-201^TM) oraz skóry: CCD-1136Sk (ATCC^Ò CRL-2697^TM) wczesnego oraz późnego pasażu (przyjętych jako model starzejącego się organizmu człowieka) po narażeniu na związki konserwujące wybrane z portfolia najczęściej stosowanych w przemyśle kosmetycznym/farmaceutycznym (chlorku benzalkoniowego, 2-fenoksyetanolu oraz 2 pochodnych kwasu 4-hydroksybenzoesowego: estru metylowego i propylowego).

Do oceny procesu apoptozy zastosowano pomiar wiązania znakowanego fluorescencyjnie białka Aneksyny V sprzężonej z izotiocyjanianem fluoresceiny-FITC, który pozwala na wykrycie zmian konformacyjnych błony komórek i utraty asymetrii w rozmieszczeniu lipidów błonowych, związanej z translokacją fosfatydyloseryny (główny składnik fosfolipidów błony) do zewnętrznej warstwy błony bez naruszania jej integralności, oraz oznaczanie aktywności enzymatycznej kaspaz-3/7 metodą FLICA (Fluorochrome Labeled Inhibitors of Caspases).  Badania poziomu apoptozy w komórkach wykonano przy użyciu cytometru obrazowego z wbudowanym mikroskopem fluorescencyjnym NucleoCounter NC-3000.

Otrzymane wyniki badań wskazują, że badane substancje konserwujące mogą zaburzać (nasilać) fizjologiczny proces programowanej śmierci komórkowej przez intensyfikację kaskady kaspaz oraz translokacji błonowej fosfatydyloseryny.

Stwierdzono, że spośród badanych substancji konserwujących największe zagrożenie dla komórek in vitro stanowił chlorek benzalkoniowy, który (mimo zastosowania 10-krotnych rozcieńczeń w stosunku do pozostałych konserwantów) działał najsilniej proapoptotycznie na starzejące się ludzkie komórki linii wyprowadzonych z płuc oraz skóry.

Stwierdzono także, że starzejące się fibroblasty różnego pochodzenia (skóra versus płuca) reagują odmiennie na apoptozę wyrażoną aktywnością kaspaz-3/7, zachodzącą pod wpływem badanych konserwantów – fibroblasty wyprowadzone ze skóry stają się z wiekiem bardziej wrażliwe (co potwierdziła także ich 24-godzinna obserwacja przy użyciu systemu do przyżyciowej analizy komórek w czasie rzeczywistym, tzw. real-time IncuCyte® S3 Live-Cell Analysis System), podczas gdy fibroblasty płucne w miarę starzenia stają się bardziej odporne na wzrost aktywności kaspaz-3/7 pod wpływem substancji konserwujących, co może wskazywać, że większe zagrożenie dla zatrudnionych w kontakcie z nimi pracowników w starszym wieku będzie związane z narażeniem dermalnym.

Z kolei w miarę starzenia się zarówno fibroblasty wyprowadzone z płuc, jak i ze skóry stawały się bardziej odporne na apoptozę ocenianą na podstawie stopnia translokacji błonowej fosfatydyloseryny. Może to  wskazywać na to, że mechanizm nasilonej apoptozy w komórkach organizmów pracowników-seniorów będzie związany raczej ze wzrostem aktywności enzymatycznej kaspaz wykonawczych, a nie zmianami konformacyjnymi błon komórkowych.

Zaobserwowano również, że diploidalne ludzkie fibroblasty skórne charakteryzują się znacznie większym poziomem programowanej śmierci komórkowej ocenianej translokacją błonowej fosfatydyloseryny oraz aktywnością kaspaz efektorowych 3 i 7 niż diploidalne ludzkie fibroblasty płucne (tak wyjściowo, jak i po narażeniu na badane substancje konserwujące), co wskazywałoby na większą podatność na apoptozę komórek skóry niż układu oddechowego.

	Projekt I.N.13. Porównanie współczynników apoptozy wyznaczonych dla fibroblastów płucnych (CCD-8Lu) i skórnych (CCD-1136Sk) na podstawie aktywności enzymatycznej kaspaz-3/7 w młodych i starych komórkach po narażeniu na substancje konserwujące

Na podstawie otrzymanych wyników opracowano Materiały informacyjne na temat oddziaływania badanych związków chemicznych na starzejące się komórki organizmu i udostępniono je w serwisie internetowym CIOP-PIB. Opracowano także i wydano drukiem broszurę Zagrożenia dla pracowników 60+ stwarzane przez wybrane substancje konserwujące dodawane do kosmetyków i/lub leków oraz zasady bezpiecznej pracy z nimi. Materiały te zostały zweryfikowane na seminarium z udziałem przedstawicieli ich użytkowników.

Wyniki projektu przedstawiono w 1 publikacji w czasopiśmie o zasięgu krajowym i 2 publikacjach przygotowanych do czasopism o zasięgu międzynarodowym oraz zaprezentowano na 1 konferencji krajowej i 1 konferencji międzynarodowej.

Unit: Pracownia Toksykologii

Duration: 01.01.2017 – 31.12.2019